Автор: Ivan Bedzhov
сайт: cellgate.wordpress.com
Култивират се ин витро ембриони до фаза бластоцист в среда за стволови клетки съдържаща Lif (Leukemia inhibitory factor) и фибробласти .
Ембрионите се прикрепват към слоя фибробласти, а средата промотира разрастването на вътрешната клетъчна маса (ICM – inner cell mass). След трипсинизиране, дисоциираните клетки се прехвърлят в ново петри със същата среда и образуват колонии от стволови клетки.
1. Подготовка за изолиране на преимплантационни ембриони.
Няма да се спирам в подробности на техниките за изолиране на преимплантационни ембриони, надявам се да имам време да го направя в отделен постинг, но в общи линии процедурата е следната. Кръстосвате мишки от избраната от вас линия. Три дни след това убивате хуманно женската и отпрепарирвате овариума, овидукта и утеруса. Промивате овидукта с M2 среда (на Sigma) и събирате ембрионите, които би трябвало да са във фаза морула (Е 2.5). Премествате ги с помощта на стъклена пипета в среда за култивиране (KSOM, FHM, M16, GM501 – culture) и CO2 инкубатор (10% CO2, 37 градуса С). Култивирате ги до фаза компактизирана морула или бластоцист.
2. Премахване на зона пелуцида.
Тази стъпка е опция. Има своите предимства и недостатъци.
а) Предимства. Ин витро култивирания бластоцист във фаза Е4.5 се освобожава сам от зона пелуцида, но това не правило, което се случва винаги. Ако не се освободи, ембриона умира и не се прикрепя към фибробластите. В нова статия побликувана в Cell, авторите твърдят, че премахването на зона увеличва извличането на стволови клетки .
б) Недостатъци. Премахването на зона пелуцида се осъществява чрез субстанция от соли с високо pH, нар. Tyrode`s solution (Sigma), която може да увреди ембрионите, ако останат по-дълго в нея.
Премахване на зона чрез Tyrode`s solution. Необходимо ви в четири ямково петри. В една ямка слагате 100 – 150 микролитра среда GM501 Air и прехвърляте ембрионите там. В друга ямка отпипетирвате същия обем Tyrode`s solution. Другите две ямки ги пълните с М2 среда (или GM501 Air). Прехвърляте 3 – 4 ембриона в Tyrode`s solution, фокусирате на бинокуляра зона и ноблюдавате постоянно за промени. Първоначално периветелинното протстранство (между ембриона и зона) ще се разрастне, след това ще се случи обратния процес – зона ще се свие плътно до ембриона и накрая ще изчезне. В този момент преместете ембриона веднага в първата ямка с М2 среда и след това във втората за да промиете ембриона. След това преминете към стъпка 3.
Изчезването на зона в Tyrode`s solution може да е от 2-3 до 10 минути. Ако зона не изчезва използвайте нова капка с Tyrode`s solution. Внимавайте да не внесете много от средата с ембрионите, това променя pH на Tyrode`s solution и спира реакцията.
3. Трансфер на ембрионите в среда за култивиране на стволови клетки.
Необходими са ви 96 ямкови плаки покрити с фибробласти. Премахвате средата за култивиране на фибробласти и я заменяте с такава за култивиране на стволови клетки. Прехвърляте всеки ембрион в отделна ямка. Средата за стволови клетки е следната: 400 мл DMEM (Biochrom, Gibco), 75 ml 10% FCS (Gibco), oт 1000x stock: 5 ml Penicillin / Streptomici, 5ml L-Glutamine, 5ml Piruvate, 5ml Non essential amino acids; 3,5 μl β-mercaptoethanol, 1000 U Lif.
4. Разрастване на вътрешната клетъчна маса (ICM – inner cell mass).
Три – четири дни след прикрепване не бластоциста към фибробластите, вътрешната клетъчна маса се разраства, а трофектодермата се диференцира в т.нар. гигантски клетки (Giants cells), които мигрират. На този етам трябва добре да трипсинизирате клетките и да ги прехърлите в нова ямка с фибробласти.
